間充質(zhì)干細胞（mesenchymalStallcells，MSCs）作為一種成體干細胞，具有未分化細胞的特性，能高效率的自我更新，并且有著向多種成熟細胞分化的潛能。在生物醫(yī)學和組織工程中具有巨大的科研價值。骨髓是第一個被報道含有MSCs的組織來源，也是如今臨床應用的主要來源，但獲取過程有創(chuàng)。易導致感染、出血、慢性疼痛，并且其增殖、分化潛能均隨年齡的增長而降低。因此對于老年患者的效果得不到保證。我國現(xiàn)已逐步進入老齡化社會，臨床上帕金森?。≒arkinson’sdisease.PD）患者已達到200萬人。每年新增PD患者近20萬人。如不及時進行有效的治療，患者病情呈慢性進行性加重，晚期往往全身僵硬、活動受限，其中約30％的中晚期患者生活不能自理，最后死于各種并發(fā)癥閉。近年來，有研究者從人臍帶血（humanumbilical cord blood，HOCB）中分離出MSCs。并且成功將其分化為成骨、軟骨、脂肪等中胚層細胞及外胚層的神經(jīng)元131。由于臍血取材容易，來源豐富，免疫原性較弱。能耐受更大程度上的人類白細胞抗原配型不符等諸多優(yōu)勢，被眾多學者推薦為骨髓的替代來源。本文就臍血MSCs的分離及其效率、生物學特性、體外誘導分化情況以及移植治療PD前景做如下綜述。

    一、臍血的組成成份

    目前認為，臍血中不但含有豐富的造血干細胞Oaematopoietic stemcells。HSCs），還存在多種非造血干細胞和前體細胞，如MSCs、內(nèi)皮前體細胞（endothelialprogenitor cells，EPCs）和非限制性體干細胞（unrestricted sonmtic stem cells，USSCs）等。Ingram等根據(jù)EPCs的克隆形成和增殖潛能。在EPCs中鑒定出一種新的細胞群并命名為高增殖潛能。I-IPP、ECFCs），這些細胞能夠完成超過100次群體倍增?？梢孕纬啥壓腿壖?，并保持很高的端粒酶活性。同時Kogler等發(fā)現(xiàn)，改變分離和培養(yǎng)條件，可使USSCs向MCSs方向轉(zhuǎn)化，且USSCs不表達透明質(zhì)酸酶。I（HASl），因此可將USSCs認為是MSCs的早期中胚層前體細胞。也有學者采用X、Y染色體特異的DNA探針進行熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)。臍血里的MSCs來源于胎盤的胎兒面細胞。

    二、臍血MSCs分離及其效率

    迄今為止。足月的HUCB是否能成為分離多能MSCs的來源依然存在爭論。Wexler等在MSCs條件培養(yǎng)基里培養(yǎng)出來的第二代成纖維樣貼壁細胞CD45、CDl4呈陽性表達，而CD44、CD90、CD29陰性表達。由此得出結(jié)論：CB貼壁單核細胞具有的是HSCs形態(tài)學特征而非MSCs。隨后，越來越多的研究小組成功從足月HUCB中分離出MSCs，但大多由于HUCB中MSCs含量低（不超過骨髓含量的1／3），培養(yǎng)條件要求高，個體差異性大，導致分離成功率低下。Perdikogianni等在高接種密度、高樣本容量、高濃度成纖維細胞生長因子-2促分裂增殖的情況下。也只從25％HUCB樣本中分離出MSCs。并且原代培養(yǎng)時間長達34d，隨后需要55d才可繼續(xù)傳代。也有學者在排除孕齡和生產(chǎn)方式對MSCs獲得率的影響后得出分離培養(yǎng)臍血MSCs的最優(yōu)化條件：樣本處理時間≤15h、樣本量I>33mL、接種數(shù)≥103、胎牛血清包被培養(yǎng)瓶、無凝血、無溶血，成功率從28.8％提高到63％。已有報道證明早產(chǎn)兒臍血分離MSCs成功率明顯高于足月產(chǎn)，表明早產(chǎn)兒臍血中含有更多的MSCs，這可能與發(fā)育過程中造血部位向骨髓的遷移有關(guān)。另外，HUCB凍融易造成凝血，嚴重影響單核細胞的提取。幾乎得不到貼壁的MSCst“1?？傊?，影響HUCB分離效果的因素很多，包括MSCs大小、表面粗糙程度、疏水性強弱、細胞彈性強弱等It21.目前的分離方法和技術(shù)尚不能達到像骨髓、脂肪、臍帶等來源MSCs的分離效率。因此，盡管HUCB來源豐富。但是不是以后MSCs臨床治療的有效來源依然是研究者爭論的焦點問題。

    三、臍血MSCs體外生物學特性

    原代培養(yǎng)的臍血MSCs表現(xiàn)的是一種混雜的細胞群。包括破骨樣細胞和成纖維樣細胞。破骨樣細胞顯微鏡下表現(xiàn)出形態(tài)多樣性。增殖能力有限，隨著傳代會被逐漸去除。而成纖維樣細胞（aPMSCs）鏡下表現(xiàn)為均一的雙極長梭形。胞體較骨髓MSCs稍小，成克隆樣生長。約3~4周可達到融合狀態(tài)，>85％的細胞處于早期靜止未分化狀態(tài)。具有很強的增殖分化潛能。有報道稱臍血MSCs體外可連續(xù)培養(yǎng)60代，并對前42代細胞進行染色體組型分析發(fā)現(xiàn)長期培養(yǎng)的臍血MSCs仍可保持穩(wěn)定的染色體型（46.XY），意味著可以保留其原有的增殖分化及自我更新的能力。這是與骨髓MSCs相比最明顯的優(yōu)勢之一。

    目前臍血MSCs的鑒定主要是通過形態(tài)、功能以及在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的分化表型等分析，尚沒有直接的方法能鑒定臍血MSCs。但大多研究證明臍血MSCs陽性表達典型的MSCs表面標志CD29、CD44、CD73、CD90、CDl05、CDl66以及于細胞標志CDl33。陰性表達造血f細胞標志CDlla、CDllb、CDl4、CD34、CD45tul。另外不表達MHC.Ⅱ類抗原及共刺激分子B7.1（CD80）。B7.2（CD86）和CD40／CD40L。故不能識別異體基因抗原，且由于缺少免疫激活信號傳導中兩條共同刺激通道，從而具有免疫耐受特性。

    四、臍血MSCs體外誘導分化

    關(guān)于臍血MSCs體外誘導分化的具體機制尚不明確。目前認為主要與細胞外環(huán)境和細胞內(nèi)基因的選擇性表達有關(guān)。近年來。研究者對臍血MSCs體外定向誘導分化方法做了大量的研究。主要是通過細胞因子、生長因子、化學抗氧化劑改變細胞外局部微環(huán)境或者導入特定基因影響相關(guān)蛋白表達對分化進行調(diào)控。Kogler等從臍血中分離的CD45一細胞體外不但可以分化成成骨細胞，軟骨細胞、脂肪細胞和造血細胞，用含有神經(jīng)生長因子mGF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）、雙丁酰環(huán)磷酸腺苷（曲-cAMP）、異丁基甲基黃嘌呤（mMX）和維甲酸（RA）的培養(yǎng)基進行誘導4周后發(fā)現(xiàn)，臍血MSCs也可跨胚層向神經(jīng)元分化。包括星形膠質(zhì)細胞和表達神經(jīng)微絲蛋白（NF）、鈉通道蛋白和多種神經(jīng)遞質(zhì)的成熟神經(jīng)元，并且有>30％的細胞酪氨酸羥化酶（TH）表達陽性。也有學者采用3步誘導法：[（1）胰島素一鐵傳遞蛋白一硒補充劑（ITS）、B27、bFGF、RA誘導l周；（2）ITS、B27、db.cAMP、抗壞血酸（從）誘導4d；（3）rrs、B27、forskolin、IBMX、AA誘導3d1成功誘導出成熟神經(jīng)元。并且RT.PCR檢測到中腦多巴胺（DA）能神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄像關(guān)基因、Null、Ptx3、Pax2、Wntl和mRNA的表達，這為臍血MSCs移植治療PD提供了可能性。Greschat等舊用XXL條件培養(yǎng)基誘導臍血MSCs7d后神經(jīng)十細胞標志DCX表達陽性率為（84.70+2.96）％。14d后早期神經(jīng)元標志NF及pIII-mbulin表達陽性率分別達（63.10±2.15m和（61.10±2.52）％，21d即可檢測到成熟神經(jīng)元標志突觸素（s”）和神經(jīng)元核fNeuN）的表達，在加入誘導劑DA4h后，TH陽性率從（32.0±1.9啪上升至（78.9±1.9）％，卻未見其他兒茶酚胺合成酶（DBH、PNMT）的表達，并且膜片鉗及高效液相檢測到大約68％的細胞可以通過L型鈣通道自發(fā)分泌DA及其在神經(jīng)元內(nèi)的代謝產(chǎn)物3，4.雙羥苯乙酸（DOPAC）和5.羥基吲哚乙酸（5.Hl從）。由此可見。臍血MSCs在體外不但可以分化出成熟的神經(jīng)元。還可定向分化為具有功能的DA能神經(jīng)元。預示著其治療PD的可能性。但是迄今為止也沒有體外完全分化成DA能神經(jīng)元的報道。而且不同的誘導方案分化率也不同。因此探索其分化的具體機制及建立穩(wěn)定的誘導方法是今后研究者們的主要方向。

    五、臍血MSCs移植治療PD的現(xiàn)狀

    目前，PD的治療主要包括內(nèi)科藥物治療、外科手術(shù)治療和于細胞移植治療。雖然藥物治療對于早期PD患者療效確切，能夠起到緩解癥狀的作用。但是都不能延緩本病進展。達到根治的目的，而且隨著口服藥物時間的延長，疾病的自然進展，單次藥物的劑量需要不斷加大。服用藥物的間隔時間不斷縮短，出現(xiàn)開關(guān)現(xiàn)象、藥物耐受現(xiàn)象等副作用：同時。長期服用還可以加重對中腦內(nèi)殘余DA能神經(jīng)元的損傷。PD的外科治療對于中晚期PD患者具有較好的療效。但是。核團毀損術(shù)由于是破壞性手術(shù)，長期療效相對較差：腦深部電刺激（DBS）手術(shù)療效確切，有逐漸取代核團毀損術(shù)的趨勢，然而，DBS的高昂價格又限制其能夠得到廣泛的應用：同時，手術(shù)本身也存在著風險。而且。無論是內(nèi)科治療還是外科治療。都只是緩解癥狀的手段。屬于對癥治療，并不能阻止和逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)元的變性。直到干細胞移植理論和實驗研究的深入。才為PD的根本治愈提供了一種可能。臍血MSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病不僅僅是發(fā)揮其替代作用，更重要的是可以提供神經(jīng)營養(yǎng)促使其自我修復。而且自體同源的臍血MSCs可以排除免疫排斥的副作用。大大提高移植的成功率。臍血MSCs移植治療創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷、腦缺血例及阿爾茨海默病1211已得到證實，并存在向臨床轉(zhuǎn)化的可能性。但是在PD的治療上尚處于探索階段，有學者用Hoechst33258標記的臍血MSCs植入PD模型鼠的紋狀體，發(fā)現(xiàn)MSCs可在腦內(nèi)長期存活（>8周），并且有向病變區(qū)域遷移的趨勢。同時表達神經(jīng)元標志物--神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和TH，實驗組DA含量明顯高于對照組閻。這表明MSCs在大鼠腦內(nèi)微環(huán)境的作用下可模仿神經(jīng)干細胞的行為，沿著一定的路徑遷移，而且有向功能神經(jīng)元分化的潛能。也有學者將BrdU標記的臍血MSCs注入岳羥多巴胺PD大鼠模型的右側(cè)紋狀體。發(fā)現(xiàn)移植組4周后阿樸嗎啡誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為較對照組明顯減少（每30分鐘大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為212±60、340±30）。差異有統(tǒng)計學意義（P<O.05），而且無一例大鼠意外死亡。由此可見。臍血MSCs移植可有效緩解PD癥狀。但是治療的具體機制目前尚未闡明。大多數(shù)學者傾向于認為臍血含有豐富的多種干細胞，在人工培養(yǎng)條件下或者腦內(nèi)微環(huán)境誘導分化替代、修復退化的DA神經(jīng)元，進而改善PD癥狀。另外，有研究證實臍血MSCs移植后。能促使神經(jīng)元突觸延伸至損傷位點。對殘余的神經(jīng)軸索起到保護作用，并刺激內(nèi)生的神經(jīng)前體細胞產(chǎn)生，說明其具有神經(jīng)保護和促神經(jīng)重建功能。

    越來越多的證據(jù)證明MSCs具有低免疫原性。更重要的是它同時也有免疫調(diào)節(jié)作用闡。樹突狀細胞（dendriticcells，DCs）是中樞免疫系統(tǒng)內(nèi)重要的抗原提呈細胞，臍血MSCs不但可呈濃度依賴性的抑制外周血單個核細胞的免疫反應，還可促使DCs靜止在前體階段并誘發(fā)其凋亡；同時分泌II.-6導致DCs功能缺失閣，說明臍血MSCs同樣具有免疫調(diào)節(jié)作用。可作為同種異體移植有效防止免疫排斥反應而保證存活率的良好種子細胞來源。國內(nèi)有學者證實中腦黑質(zhì)中a-synuclein的異常過度表達可大量激活DCs而加重該區(qū)域的炎癥反應。從而導致DA能神經(jīng)元的凋亡冊，這也是PD的重要發(fā)病機制之一。如此說來，假如臍血MSCs移植能有效發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)特性。則可通過抑制中腦黑質(zhì)區(qū)的免疫炎性反應有效緩解DA神經(jīng)元的凋亡。起到減慢PD發(fā)病進程的作用。但目前國內(nèi)外尚無此類報道。這將是MSCs移植治療PD的一個新的突破口。

    盧國輝等，中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2012,11（3）：