基因治療則為血友病的長期緩解乃至治愈帶來了希望。靶組織或細(xì)胞選擇范圍廣泛、FⅨ基因片段小、低水平表達(dá)即可明顯改善出血、具有良好的動物模型等優(yōu)勢，使得血友病B成為基因治療領(lǐng)域進(jìn)展最為迅速的疾病之一。

    血友病B是一種X染色體連鎖隱性遺傳病，因編碼基因的改變而導(dǎo)致凝血因子Ⅸ（FⅨ）的缺乏。在男性中發(fā)病率約為1/25 000 ,依據(jù)血漿FⅨ活性（FⅨ∶C）分為重型（FⅨ∶C<1%）、中間型（F Ⅸ∶C 1%——5%）和輕型（F Ⅸ∶C >5% ,≤40%）。

    目前該病主要治療手段為替代治療（輸注血漿提取物或重組FⅨ制劑），但反復(fù)輸注外源性FⅨ可引起FⅨ抑制物形成、血制品輸注相關(guān)疾病且醫(yī)療費(fèi)用昂貴。


    一。載體系統(tǒng)

    1.腺相關(guān)病毒載體：腺相關(guān)病毒載體（AAV）是目前血友病B基因治療最有前景的載體。AAV是一種可感染人細(xì)胞、具有天然復(fù)制缺陷的單鏈DNA 病毒，與已知人類疾病無關(guān)。AAV較之其他病毒載體具有免疫原性弱、轉(zhuǎn)染效率高、可轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞、表達(dá)穩(wěn)定且持續(xù)時間長等優(yōu)點，缺點為容量小、基因表達(dá)滯后。

    AAV包括AAV1、2、5、6、7、8、9 等多種血清型。AAV2 是應(yīng)用最早、最廣泛的血清型，可有效轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞，但人類是AAV2的天然宿主，人群中AAV2血清抗體陽性者較為常見。其他幾種血清型則有不同的轉(zhuǎn)染趨向性：AAV1具有明顯的骨骼肌趨向性，AAV6具有心肌趨向性，AAV8具有明顯的肝趨向性。針對不同的靶組織可以考慮選擇趨向性不同的AAV.

    總體而言，AAV7、8、9 產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較AAV1、2、5 輕。Wang 等分別應(yīng)用AAV1、2、5、7、8、9 對FⅨ基因敲除小鼠和患血友病B犬進(jìn)行基因治療，然后對血漿中FⅨ∶C、抗FⅨ特異性IgG1 和IFN-γ進(jìn)行檢測，以比較其轉(zhuǎn)染效率和免疫反應(yīng)。

    結(jié)果顯示以肌肉組織作為靶組織時，AAV7、8、9 轉(zhuǎn)染效率高于AAV1、2、5,未發(fā)現(xiàn)針對導(dǎo)入的FⅨ基因的B細(xì)胞反應(yīng)，針對病毒衣殼蛋白的T細(xì)胞反應(yīng)程度亦較弱。自身互補(bǔ)AAV 載體（self-complementaryAAV, scAAV）的發(fā)明則彌補(bǔ)了傳統(tǒng)單鏈AAV 載體（singlestrandedAAV, ssAAV）表達(dá)滯后的缺點。

    ssAAV表達(dá)滯后的原因在于其進(jìn)入靶細(xì)胞并脫殼后，首先要合成互補(bǔ)DNA鏈才能進(jìn)一步表達(dá)。scAAV則是將載體基因設(shè)計成1 個單鏈反向重復(fù)序列，當(dāng)載體進(jìn)入靶細(xì)胞后即可折疊形成1 條互補(bǔ)雙鏈，從而繞開影響基因表達(dá)速度的步驟。

    Nathwani 等采用scAAV5 和scAAV8 作為攜帶FⅨ編碼基因的載體對患血友病B獼猴進(jìn)行基因治療并研究其安全性。研究者將獼猴分為5 組，分別從外周靜脈注射2×109——2×1012 載體基因組（vg）/kg 共5 個劑量級的載體，然后對基因表達(dá)效率和安全性進(jìn)行了長達(dá)5 年的觀察。

    研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)載體劑量達(dá)到6×1010 vg/kg 時，獼猴血漿FⅨ∶C維持在1%以上；所有的獼猴均產(chǎn)生了血清型特異性抗體，未發(fā)現(xiàn)衣殼蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)和免疫介導(dǎo)的肝損傷，同時沒有觀察到AAV基因整合到靶細(xì)胞基因序列中和肝臟腫瘤的發(fā)生。該研究及大量制備scAAV的方法為臨床試驗打下了基礎(chǔ)。AAV的缺點為包裝容量較小，影響了在血友病A等其他基因缺陷性疾病的應(yīng)用。

    2.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：

    逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（RV）是最早應(yīng)用于基因治療的病毒載體，但僅對分裂細(xì)胞有效，對非分裂細(xì)胞則無效。Zhang 等以RV作為載體、以肝臟作為靶組織對新生血友病B犬和新生基因敲除血友病B小鼠進(jìn)行基因治療，結(jié)果顯示所有動物中FⅨ∶C>10%,無FⅨ抑制物形成。

    但成年動物的肝臟中分裂細(xì)胞不足，有報道以手術(shù)切除部分肝臟的方法誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖，再應(yīng)用RV進(jìn)行基因治療，但該治療方法創(chuàng)傷較大，與其他載體相比劣勢較為明顯。

    3.腺病毒載體：

    腺病毒載體（AV）可轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞。腺病毒基因不與宿主基因整合，不會因為基因整合而導(dǎo)致抑癌基因失活。人群可天然感染腺病毒而易預(yù)存免疫反應(yīng)。第二代AV（高容量AV）腺病毒本身的編碼基因被去除，可以降低宿主免疫反應(yīng)，延長導(dǎo)入基因表達(dá)持續(xù)的時間。

    4.慢病毒載體：

    慢病毒載體（LV）是以HIV-1 為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，可轉(zhuǎn)基因至分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，對包括肝在內(nèi)的各種組織都可轉(zhuǎn)染，也可將載體基因整合至宿主基因中。因為LV來源于HIV,在普通人群中少有感染，很少有預(yù)存免疫反應(yīng)，在基因治療上具有一定的優(yōu)勢。

    但是應(yīng)用LV作為載體進(jìn)行基因治療時，F(xiàn)Ⅸ∶C僅接近1%,且有一過性急性促炎性免疫反應(yīng)發(fā)生。Brown等應(yīng)用攜帶肝細(xì)胞特異性啟動子的LV載體對基因敲除血友病B小鼠進(jìn)行治療，F(xiàn)Ⅸ∶C因抗FⅨ的T細(xì)胞反應(yīng)而未達(dá)治療水平（<1%），當(dāng)他們在載體中再包進(jìn)一段造血特異性miRNA后進(jìn)行基因治療，小鼠體內(nèi)FⅨ∶C持續(xù)高于15%且未發(fā)生明顯的免疫反應(yīng)，分析認(rèn)為，miRNA可能在T細(xì)胞反應(yīng)的免疫失活中起了重要作用。

    Mátrai 等報道應(yīng)用整合酶缺陷的慢病毒載體對基因敲除血友病B小鼠進(jìn)行基因治療，在基因有效表達(dá)的前提下誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受，并降低基因插入誘變的風(fēng)險。

    5. 非病毒載體系統(tǒng)：

    非病毒載體包括脂質(zhì)體、納米材料、沉默轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒DNA注射等，具有來源廣泛、成分明確、免疫反應(yīng)低、可大量制備等優(yōu)點。而缺點在于轉(zhuǎn)染效率低、FⅨ難以長期表達(dá)。

    Miao 等報道顯示小鼠肝內(nèi)注射裸質(zhì)粒DNA的同時結(jié)合超聲波空化可以顯著提高轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)小鼠尾靜脈高壓注射編碼FⅨ的裸質(zhì)粒DNA,達(dá)到了良好效果。相比較其他非病毒載體，沉默轉(zhuǎn)座子可以使FⅨ基因整合到宿主基因而長期表達(dá)，顯示出一定的發(fā)展優(yōu)勢。

    二。靶點的選擇

    1.肝臟：肝臟是產(chǎn)生FⅨ的主要器官，是基因治療較為理想的靶器官。早期通過肝動脈或門靜脈注射載體，一些具有肝趨向性的新載體（如AAV8）可采用靜脈注射，使治療過程簡化、風(fēng)險降低。血友病B（尤其是重型）患者常因為血制品輸注而并發(fā)肝炎，不宜選擇肝臟作為靶器官。

    2.肌肉組織：肌肉組織是FⅨ的異位合成組織，也是一個重要的治療靶點，對于合并肝炎的患者尤為適合。載體一般采用多部位肌肉注射，肌肉組織中可長期表達(dá)FⅨ。

    Buchlis 等報道1 例血友病B患者在接受基因治療（載體為AAV2 肌肉注射）10 年后因非治療相關(guān)原因死亡，注射部位肌肉組織仍可表達(dá)FⅨ，但由于免疫反應(yīng)，該患者血漿FⅨ∶C未達(dá)治療水平。

    采用加壓注射或合并使用血管活性藥物的靜脈灌注給藥法（ATVRX）可使載體在肌肉組織中廣泛分布。短程應(yīng)用環(huán)磷酰胺以抑制免疫反應(yīng)可使血漿FⅨ∶C持續(xù)維持在治療水平以上，且安全性較為理想。

    3.造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板：除了傳統(tǒng)的靶組織，有研究者致力于FⅨ基因異位表達(dá)的探索。Bigger 等以慢病毒作為載體，體外轉(zhuǎn)染小鼠造血干細(xì)胞，再植入經(jīng)致死量照射的普通小鼠及基因敲除血友病B小鼠體內(nèi)，結(jié)果受鼠體內(nèi)表達(dá)FⅨ持續(xù)1 年以上；再將受鼠的造血干細(xì)胞進(jìn)行二次和三次移植，二次或三次移植受鼠也可長期表達(dá)FⅨ，凝血功能得到顯著改善。

    另有報道使FⅨ表達(dá)于干細(xì)胞來源的紅細(xì)胞，也獲得良好效果。Zhang 等建立2bF9 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，使其FⅨ異位表達(dá)于血小板和巨核細(xì)胞，并儲存在α顆粒中，雖然血漿FⅨ∶C僅1.1%,但其中90%的FⅨ位于血小板，當(dāng)血小板激活后FⅨ可立即釋放到出血部位，止血效果優(yōu)于普通FⅨ，且具有更長的半衰期。該研究中轉(zhuǎn)基因小鼠未發(fā)生腫瘤和血栓性事件。這些研究為血友病B的基因治療開拓了思路。

    三。安全性

    1.免疫反應(yīng)：免疫反應(yīng)是影響基因治療成敗的關(guān)鍵。病毒衣殼、導(dǎo)入的載體基因、啟動子元件和增強(qiáng)子元件、載體劑量、靶點的選擇、是否合并肝炎以及先前有無FⅨ抑制物均為影響免疫反應(yīng)的因素。衣殼蛋白特異性T 細(xì)胞反應(yīng)和針對轉(zhuǎn)入基因的免疫反應(yīng)在動物實驗和臨床試驗中均為常見。

    在以AAV作為載體的基因治療中，針對病毒衣殼蛋白的免疫反應(yīng)則是導(dǎo)致FⅨ表達(dá)進(jìn)行性減少的原因。有研究顯示作為靶器官的肝臟中CD8+細(xì)胞浸潤較肌肉少見，分析認(rèn)為與肝臟中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）形成的免疫耐受有關(guān)。

    目前減低和應(yīng)對免疫反應(yīng)的策略還有：①減少載體中的空衣殼數(shù)量；②應(yīng)用高表達(dá)FⅨ的轉(zhuǎn)基因，如FⅨPadua（R338L），則可用較少載體就達(dá)到同樣療效；③在基因治療中短程應(yīng)用免疫抑制劑；④持續(xù)監(jiān)測，一旦出現(xiàn)免疫反應(yīng)及時給予糖皮質(zhì)激素。

    2.基因插入突變：載體基因若隨機(jī)整合進(jìn)宿主基因，可能引起基因插入突變。如整合到抑癌基因并致其失活，可增加腫瘤發(fā)生的危險。目前廣泛應(yīng)用的AAV載體，尚未發(fā)現(xiàn)宿主基因整合。

    多項大規(guī)模動物實驗結(jié)果大多證實AAV載體無誘發(fā)癌變傾向。如果載體基因隨機(jī)整合到精子細(xì)胞，則可引起后代基因的改變，也就是所謂的種系傳播，是人們對基因治療的一個顧慮。但研究表明應(yīng)用AAV2和AAV8靶向治療后，動物精液中載體基因僅短暫存在，經(jīng)過上百個生精循環(huán)后，精液中已無載體基因存在。

    一般認(rèn)為應(yīng)用AAV2和AAV8基因治療導(dǎo)致種系傳播的風(fēng)險較小。也有報道顯示基因治療增加了肝癌和其他惡性腫瘤的發(fā)生率。對于基因突變的安全性尚需繼續(xù)觀察和研究。

    四。臨床試驗

    Qiu 等在1996 年報道了世界首次血友病B基因治療臨床試驗。研究者用帶有FⅨ基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染患者的離體皮膚成纖維細(xì)胞，篩選出表達(dá)FⅨ的細(xì)胞，經(jīng)一系列安全性檢測后用膠原包埋，于患者腹部或背部皮下注射。2 例患者體內(nèi)血漿FⅨ水平升高2 倍多，持續(xù)超過1 年。沒有出現(xiàn)明顯的治療相關(guān)不良反應(yīng)。

    Manno 等應(yīng)用AAV2作為載體通過肌肉注射的方式對血友病B患者進(jìn)行基因治療，肌肉組織中FⅨ表達(dá)良好，但血漿FⅨ∶C<1%.通過肝動脈注射將AAV2注入血友病B患者體內(nèi)，血漿FⅨ∶C達(dá)治療水平，但8 周后逐漸下降并伴有轉(zhuǎn)氨酶升高，認(rèn)為與衣殼蛋白引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)。

    最近一則令人振奮的消息來自于英國倫敦大學(xué)學(xué)院的臨床試驗。入組的6例無FⅨ抑制物的重型血友病B患者脈注射三種劑量的scAAV8載體，所有患者外周血FⅨ∶C均達(dá)治療水平，未產(chǎn)生FⅨ抑制物，也沒有發(fā)現(xiàn)針對FⅨ基因的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，但在所有患者中均發(fā)現(xiàn)針對AAV8衣殼蛋白的體液免疫反應(yīng)，中、高劑量組的患者中還出現(xiàn)AAV8衣殼蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)。

    高劑量組的2例患者出現(xiàn)了衣殼蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)引起的轉(zhuǎn)氨酶升高，給予短程糖皮質(zhì)激素治療后恢復(fù)正常，而且FⅨ∶C仍然維持治療水平。綜上所述，近年來血友病B 的基因治療取得了很大進(jìn)展。今后需要進(jìn)行更多的動物實驗以驗證安全性并謹(jǐn)慎、嚴(yán)格地開展大規(guī)模臨床試驗。