成體干細(xì)胞的研究目前以造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)為主，但取材困難，獲得率低等不利因素使其臨床應(yīng)用受限。繼BMSC之后，脂肪源干細(xì)胞(ADSC)成為當(dāng)今干細(xì)胞研究領(lǐng)域的又一熱點(diǎn)，美國的ZUK及日本的Mizuno等研究小組對(duì)此做了深入研究并取得了一定的進(jìn)展。ADSC與BMSC有許多相似的生物學(xué)特性，但ADSC還具有取材方便、易于培養(yǎng)、收獲細(xì)胞量大的優(yōu)勢。研究表明BMSC在造血調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用，而BMSC與造血干細(xì)胞共移植能夠促進(jìn)造血重建，原因在于分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)。但ADSC是否可作為滋養(yǎng)層與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)刺激造血干/祖細(xì)胞(HSPC)增殖卻少見報(bào)道，為此我們以ADSC體外模擬造血微環(huán)境，觀察其對(duì)自身HSPC增殖的作用。

一、實(shí)驗(yàn)方法

 　1.大鼠ADSC分離培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)鼠為SPF級(jí)SD大鼠，SD大鼠腹腔麻醉后，無菌條件下切取雙側(cè)腹股溝皮下脂肪，置人含有100 U/ml青霉素和100 U/m1鏈霉素的PBS液中浸泡10 min，用PBS反復(fù)沖洗，去除可見的血管及其他非脂肪組織，將脂肪組織剪成約1 mm3小塊，置于10 ml的0.1%I型膠原酶中，37℃搖床120 r/min消化30min，至懸液成糊狀，加入3倍體積的PBS終止消化，以1200×g離心10 min，棄上清，沉淀用含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。以2×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h首次換液，以后每3 d換液1次。細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)消化傳代。

  　2.用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測ADSC免疫表型：分別取第3～6代細(xì)胞，用25 g/L胰蛋白酶消化后，PBS洗2次，制成1×106/ml的單細(xì)胞懸液，設(shè)陰性對(duì)照和同型對(duì)照組，分別加CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD49d-FITC及CD106-PE單克隆抗體(單抗)，室溫下避光孵育15 min，F(xiàn)CM檢測。

  　3.成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化：①誘導(dǎo)組取第3代ADSC，待細(xì)胞融合80%，加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(加10%FBS、0.1μmol/LJ也塞米松、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的LG-DMEM)；②對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)，每3 d換液1次。誘導(dǎo)7 d后，兩組均行茜素紅染色。

  　4.成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化：①誘導(dǎo)組：取第3代ADSC，待細(xì)胞融合80%，加入成脂細(xì)胞誘導(dǎo)液(含10%FBS 1 μmol/L、地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L 3-異丁基1-甲基黃嘌呤、10 μmol/L胰島素的LG-DMEM培養(yǎng)液)；②對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)，隔日換液。誘導(dǎo)7 d后，兩組均用油紅O染色。

  　5.BMSC對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNC)體外長期培養(yǎng)擴(kuò)增影響的觀察：取大鼠骨髓，制成單細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液分離MNC，用LG-DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×105/ml，置于絲裂霉素C處理的BMSC上，共培養(yǎng)5周后用胰蛋白酶消化后重新接種，3 h后，收集上清中非貼壁細(xì)胞，甲基纖維素培養(yǎng)基(購白Stem cell公司)進(jìn)行細(xì)胞集落培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d計(jì)數(shù)分析。

  　6.ADSC支持HSPC體外擴(kuò)增能力的觀察：將BMNC作為長期培養(yǎng)啟動(dòng)細(xì)胞(LTC-IC)，大鼠胚胎來源成纖維細(xì)胞、BMSC、ADSC作為滋養(yǎng)層。將實(shí)驗(yàn)分為四組：A組：單純BMNC；B組：BMNC加成纖維細(xì)胞；C組：BMNC加BMSC；D組：BMNC加ADSC。在5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每7 d換HSPC長期培養(yǎng)液(購自Stem cell公司)，并于培養(yǎng)第7、14、28天取培養(yǎng)液中非貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞集落培養(yǎng)和分析，并于35 d收集上清，用ELESA方法檢測SDF-1，F(xiàn)CM檢測CD34陽性細(xì)胞率。

二、結(jié)果

  　1.ADSC的增殖特征：原代細(xì)胞培養(yǎng)48 h首次換液，可見有少量細(xì)胞貼壁生長，呈短小梭形，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞呈簇狀生長并匯合呈漩渦狀排列，培養(yǎng)5～7 d傳代，傳至第6代(P6)細(xì)胞形態(tài)呈梭形、大小較一致(圖1a)。

  　2.ADSC的免疫表型：經(jīng)FCM檢測，CD34+細(xì)胞占(18.9±6.2)%，CD49d+細(xì)胞占(0.8±0.2)%，CD29+細(xì)胞占(99.1±0.5)%，HCAM+細(xì)胞占(1.6±0.7)%，CDl06+細(xì)胞占(5.7±2.1)%，對(duì)照組均為陰性。

  　3.成脂細(xì)眙誘導(dǎo)升化：加入成脂細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)養(yǎng)后2～3d，細(xì)胞開始回縮變?yōu)槎嘟切危? d后細(xì)胞質(zhì)可見較少脂質(zhì)，7 d時(shí)匯合為較太的脂質(zhì).油紅O染包可見細(xì)胞脂滴染色呈陽性(圖1b，)。

  　4.成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化加：成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基后3 d細(xì)胞逐漸停止擴(kuò)增變成短梭形約，10d形成結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，笫14天茜索紅辨色呈陽性(圖1 c)。

　　a:倒置顯微鏡下ADSC形態(tài)（×200）；b ：ADSC成脂誘導(dǎo)分化后油紅O染色（×100）；c：ADSC成骨誘導(dǎo)分化后茜素紅染色（×200）

圖1   第3代脂肪源干細(xì)胞（ADSC）形態(tài)及成脂、成骨誘導(dǎo)分化后組化染色結(jié)果