作者：南京鼓樓醫(yī)院    施曉雷  韓冰  丁義濤

    導(dǎo)讀：我國(guó)是乙肝大國(guó)，乙型肝炎病毒攜帶者約占世界總數(shù)的三分之一，其中相當(dāng)一部分患者會(huì)逐步發(fā)展成急性或慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，最終發(fā)展為肝功能衰竭。然而，由于供體器官嚴(yán)重短缺等多種原因，目前僅少部分肝功能衰竭患者獲得肝移植機(jī)會(huì)。因此，能夠取代部分肝臟功能的人工肝支持系統(tǒng)得以迅速發(fā)展。

    人工肝支持系統(tǒng)包括非生物人工肝（ALS）和生物人工肝（BAL）。前者不含生物組分，主要利用濾過(guò)和吸附原理清除毒素，類(lèi)似于血液透析治療。但ALS不能完全替代肝臟，這就促使肝病工作者致力于含有生物成分，能夠綜合發(fā)揮肝臟氧化脫毒、生物轉(zhuǎn)化、分泌與合成等功能的BAL研究。

    BAL核心元件一：生物反應(yīng)器

    生物反應(yīng)器是BAL核心組成部分，理想BAL反應(yīng)器應(yīng)能達(dá)到：①為肝細(xì)胞提供良好的長(zhǎng)期生長(zhǎng)代謝環(huán)境；②能發(fā)揮必需的肝臟功能；③體積小，死腔少。就結(jié)構(gòu)而言，目前生物反應(yīng)器分以下4種。

    中空纖維管式  中空纖維管分為內(nèi)腔和外腔，一般將肝細(xì)胞黏附生長(zhǎng)于外腔，內(nèi)腔有血漿通過(guò)，是目前應(yīng)用最多的一類(lèi)反應(yīng)器。中空纖維管反應(yīng)器最大優(yōu)點(diǎn)是較大的表面積/體積比，便于代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)，且保持最小死腔。但由于肝細(xì)胞在反應(yīng)器中分布不均，易造成細(xì)胞活力下降。

    單層/多層平板式  該反應(yīng)器是將肝細(xì)胞直接種植于平板上，優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞分布均勻，微環(huán)境一致，但表面積與體積之比下降。本中心在國(guó)內(nèi)第一個(gè)自主研發(fā)新型多層平板型生物反應(yīng)器。反應(yīng)器大致由三部分組成：多層平板、中空支架和外殼。本反應(yīng)器特點(diǎn)為：①體積僅480ml,對(duì)人體血液動(dòng)力學(xué)無(wú)影響；②能承載1010量級(jí)細(xì)胞，滿足臨床治療要求。此外，每層平板采用電紡方式引入殼聚糖納米纖維支架，促進(jìn)肝細(xì)胞與材料間的黏附力，保證細(xì)胞數(shù)量及其功能維持。

    灌流床/支架式  該生物反應(yīng)器提供固相載體使肝細(xì)胞黏附固定，肝細(xì)胞黏附并生長(zhǎng)于孔隙中，大大降低因介質(zhì)流動(dòng)而造成的剪切力損傷，細(xì)胞可維持較高功能活力，輻流式反應(yīng)器即采用此種構(gòu)型，其缺點(diǎn)是灌注不均一，易堵塞。

    微囊懸液式  該生物反應(yīng)器是將肝細(xì)胞用一種半透膜材料包裹，制成多孔微囊，然后進(jìn)行灌注培養(yǎng)。其優(yōu)點(diǎn)是所有細(xì)胞具有相同微環(huán)境，有大量細(xì)胞培養(yǎng)空間，減少了免疫反應(yīng)發(fā)生。缺點(diǎn)是細(xì)胞穩(wěn)定性差，物質(zhì)交換能力受限。

    BAL核心元件二：細(xì)胞材料

    細(xì)胞材料是BAL的核心部分，細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)的活性及自身功能在很大程度上決定了BAL的治療作用。

    人體肝細(xì)胞是上皮細(xì)胞源性，需要實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間以及與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的接觸發(fā)揮作用，現(xiàn)有BAL裝置無(wú)法完全模擬肝細(xì)胞在體內(nèi)的微環(huán)境。在BAL使用時(shí)的肝細(xì)胞大多功能低下，關(guān)鍵酶活性喪失，嚴(yán)重影響B(tài)AL效能的發(fā)揮。

    理想的細(xì)胞來(lái)源應(yīng)該是功能上接近在體肝細(xì)胞，來(lái)源廣泛且臨床應(yīng)用時(shí)無(wú)免疫排斥反應(yīng)及疾病傳播的可能。因此，尋找一種能在BAL中具有高活性、高穩(wěn)定性的細(xì)胞系，是目前亟待解決的問(wèn)題。

    人類(lèi)原代肝細(xì)胞  自體肝細(xì)胞理論上講不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，是理想的BAL細(xì)胞來(lái)源。但臨床上終末期肝病患者自身病態(tài)肝細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量均不能滿足BAL肝細(xì)胞的要求，不可能作為BAL的細(xì)胞來(lái)源。

    同種異體肝細(xì)胞是另一類(lèi)較好的細(xì)胞來(lái)源，但因來(lái)源有限、同種異體存有免疫排斥及從人類(lèi)組織中提取可能會(huì)傳播一些疾病，目前已基本被摒棄。

    永生化肝細(xì)胞  這類(lèi)細(xì)胞采用成人肝細(xì)胞作為源細(xì)胞，免疫排斥反應(yīng)小，但肝功能保留不全，還存在致癌及病毒感染風(fēng)險(xiǎn)。

    肝細(xì)胞株  在體外具有無(wú)限生長(zhǎng)潛能的肝細(xì)胞株被證實(shí)是BAL一個(gè)有希望的細(xì)胞來(lái)源。這些細(xì)胞大多是從人類(lèi)肝臟腫瘤細(xì)胞分化而來(lái)，而且在體外培養(yǎng)時(shí)顯示出了很好的耐受性。

    HepG2、C3A細(xì)胞株是腫瘤源性的肝細(xì)胞株，具有無(wú)限增殖能力，在體外培養(yǎng)顯示出良好的活性及穩(wěn)定性，且具有正常肝細(xì)胞的絕大多數(shù)功能，如白蛋白合成、P450活性及尿素代謝能力。但C3A細(xì)胞本身的代謝解毒能力較弱，且作為腫瘤源性細(xì)胞株，理論上仍存在腫瘤定植可能。

    異種肝細(xì)胞  異種肝細(xì)胞是指由各種動(dòng)物肝臟分離而來(lái)的，其優(yōu)勢(shì)在于細(xì)胞來(lái)源穩(wěn)定、分離獲取方便且價(jià)格低廉。豬肝細(xì)胞是目前BAL基礎(chǔ)研究與臨床試驗(yàn)中應(yīng)用最為廣泛的一種動(dòng)物源肝細(xì)胞。

    本中心從方便、實(shí)用、高效等原則出發(fā)，選擇異種豬細(xì)胞作為新型BAL支持系統(tǒng)的細(xì)胞來(lái)源。

    干細(xì)胞  干細(xì)胞是另一類(lèi)很有希望的BAL細(xì)胞來(lái)源，在去分化狀態(tài)下無(wú)限增值，而且具有良好的分化能力，多種起源的干細(xì)胞在組織動(dòng)員方面顯示有一定的前景，特別是在BAL.

    但是，目前應(yīng)用于BAL的干細(xì)胞還處于未成熟階段。其存在問(wèn)題是還沒(méi)有一種完全有效的純化和鑒別干細(xì)胞的方法，且目前尚無(wú)法使干細(xì)胞在體外擴(kuò)增至1010數(shù)量級(jí)，這是其應(yīng)用最大的“瓶頸”.

    BAL臨床應(yīng)用前景和面臨難題

    BAL的臨床應(yīng)用前景是令人鼓舞的，但其廣泛應(yīng)用仍須努力攻克許多難題，如最佳細(xì)胞來(lái)源、體外細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定性和活性的提高、生物反應(yīng)器重建肝臟三維結(jié)構(gòu)等。

    現(xiàn)有生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)只能體現(xiàn)肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，而忽視了非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的重要性。共培養(yǎng)策略可能是一個(gè)比較有前途的開(kāi)拓領(lǐng)域，特別是肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)可以提高細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。

    肝臟中的肝細(xì)胞面臨著氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度梯度，而這個(gè)梯度是隨著其與門(mén)靜脈距離改變而變化，正是由于存在這一梯度，肝細(xì)胞顯示了不同功能。為肝細(xì)胞可以繼續(xù)發(fā)揮在正常肝臟中的所有功能，未來(lái)的生物反應(yīng)器可能需要重建這種微環(huán)境。

    隨著生物工程技術(shù)的不斷創(chuàng)新，未來(lái)的生物反應(yīng)器應(yīng)該最大化轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，這就需要發(fā)展一種稱(chēng)為三維立體***，重建肝臟三維立體構(gòu)象，并能精確定位細(xì)胞位置。

    最終，理想的生物人工肝應(yīng)該是由可完全吸收的生物人工肝置入性裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)永久的肝臟替代作用。