腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟?。–HRoNIC KIdNEydISEASE，CKD）不斷進展的共同病理改變，其程度和患者預后密切相關，但目前尚無有效的治療手段。

    由于CKD 起病隱襲，無論是在發(fā)達還是在發(fā)展中國家，很多患者在初次就診時就已經(jīng)步入CKD3 期或更嚴重的階段，此時多已存在相當程度的腎間質(zhì)纖維化，喪失了應用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等針對病因治療的時機，通常只能采取低蛋白飲食、血管緊張素Ⅱ活性抑制劑、降低血壓等一般性保守治療，而沒有更有效的針對性強的治療手段，多于數(shù)年后進展到終末期腎衰竭，而不得不加入腎臟替代治療的行列，給個人和社會均帶來沉重的經(jīng)濟負擔。

    因此進一步解析腎間質(zhì)纖維化機制，尋求新的有效干預途徑，對降低終末期腎衰竭的發(fā)病率、減少巨額醫(yī)療開支，具有重要意義。

    隨著人類基因組測序工作的完成，研究人員逐漸從基因組學研究轉(zhuǎn)向研究生命的體現(xiàn)者蛋白質(zhì)的表達模式和功能模式，但蛋白質(zhì)在生命體內(nèi)又是動態(tài)變化的，并存在多種翻譯后修飾，包括磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化和乙酰化等修飾，其中糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最主要的修飾之一，對生命體起著至關重要的作用，人體內(nèi)50％以上的蛋白質(zhì)存在糖基化現(xiàn)象，糖基化對蛋白質(zhì)的折疊、運輸、定位起著重要作用，蛋白質(zhì)的糖基化，特別是N連接糖基化普遍發(fā)生在細胞外環(huán)境的蛋白質(zhì)中，涉及到細胞免疫、蛋白翻譯調(diào)控、蛋白降解等許多疾病的病理過程。

    在腎病的炎癥、免疫紊亂的過程中均有糖類物質(zhì)結構和功能的改變，由于聚糖代謝酶類活力的改變或缺陷，可導致糖復合物中的糖鏈數(shù)量和結構產(chǎn)生異常，最終導致腎臟細胞功能失常；

    糖鏈結構異常還可能被機體免疫系統(tǒng)識別，引起細胞免疫和體液免疫應答，并激發(fā)自身免疫反應及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，介導細胞毒性反應，引起腎臟細胞的損傷，所以糖復合物中糖鏈數(shù)量和結構變化與腎病關系密切。本文試圖從糖生物學角度探討腎間質(zhì)纖維化的機制。

    一、信號通路在腎間質(zhì)纖維化作用概述

    腎臟的系膜細胞和成纖維細胞活化、小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）、單核/巨噬細胞、T 細胞浸潤及細胞凋亡等細胞學事件促進了腎纖維化的進展。

    在這些過程中有多種細胞因子、生物活性物質(zhì)的參與共同激活了多種信號通路，如：轉(zhuǎn)化生長因子β1 （TGFβ1）/SMAd2 /3 通路、血小板源性生長因子（PDGF）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路、無翅型蛋白（WNT）/β連環(huán)蛋白（βCATENIN）通路、鋸齒狀配體（JAGGEd，JAG）/翅缺痕蛋白（NoTCH）通路及大鼠肉瘤基因（RAS）通路等，多種信號通路的激活是腎間質(zhì)纖維化的核心，其中TGFβ1 激活的TGFβ/果蠅母代抗同源序列蛋白（SMAd）2 /3 通路是最為強力的致腎間質(zhì)纖維化信號通路，是近20 年來研究最為深入的致纖維化通路，其經(jīng)典的激活過程是TGFβ1 首先與其Ⅱ型受體中的TGFβRII 結合，磷酸化TGFβRII，形成具有活性的“（TGFβRII）（TGFβ1）”復合物，使Ⅰ型受體TGFβ RI 中的激活素受體樣激酶（ALK）4、ALK5、ALK7 磷酸化，形成“（TGFβRII）（TGFβ1 ）（TGFβRI）”三元復合物，激活下游的功能蛋白SMAd2 /3 或SMAd7，磷酸化的SMAdS 進入細胞核，啟動纖維化過程。

    理論上推測，阻斷或降低上述TGFβ的“致纖維化”信號傳導通路活性可能成為有臨床前景的治療腎間質(zhì)纖維化的途徑。

    事實上，從10 余年前已經(jīng)有學者開始這方面的努力：研究表明，抗TGFβ單克隆抗體、反義TGFβ1 寡核苷酸、天然的TGFβ抑制劑均能下調(diào)TGFβ表達，成功地減輕了實驗動物腎臟纖維化，但由于上述方法同時也非選擇性地抑制了TGFβ其它功能，可以導致發(fā)育異常、生長、免疫功能異常等難以克服的副作用，至今未能向臨床應用拓展。

    近來，學者們將目光轉(zhuǎn)向?qū)GFβ/SMAd2 /3 下游通路的調(diào)節(jié)上，受體蛋白TGFβRII 是其激活的關鍵下游環(huán)節(jié)，沒有該受體蛋白的活化，該通路就無法激活，對它的調(diào)節(jié)有望在抑制通路激活的同時，避免阻斷TGFβ1 所帶來的副作用。

    已經(jīng)有研究嘗試通過下調(diào)或沉默TGFβRII 基因表達、抑制TGFβI 型受體中ALK5 的磷酸化來下調(diào)TGFβ“致纖維化”通路的活性，有效地抑制了動物模型的纖維化。

    上述研究的結果說明了通過受體水平干預該通路活性對纖維化抑制的可行性和有效性，但目前仍在實驗室研究階段。

    二、腎間質(zhì)纖維化的糖生物學研究進展

    近年來的功能性糖蛋白組學在重大疾病的診斷標志物和新藥靶目標方面研究的巨大進展和廣闊的應用前景，為我們提供了一個新的研究途徑。

    由于TGFβ“致纖維化”通路中兩個關鍵起始受體TGFβRII 和ALK5 是糖蛋白，大連醫(yī)科大學腎臟病研究所課題組推測糖基化修飾對它們致纖維化功能可能有關鍵作用。

    WANG 等利用α1，6 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α1，6FUCoSylTRANSFERASE，F(xiàn)UT8）基因敲除小鼠直接有力地支持了這一推測：該研究結果表明TGFβRII 是由FUT8 催化的核心巖藻糖基化修飾的，沉默F(xiàn)UT8 使得TGFβRII 糖基化修飾不能進行，導致“TGFβ1 /TGFβRⅡ/SMAd2 /3”通路不能活化，發(fā)生肺氣腫樣改變。

    受這項研究工作的啟示，大連醫(yī)科大學腎臟病研究所課題組首次探討了腎間質(zhì)纖維化過程中，核心巖糖基化修飾通過修飾TGFβRII 對腎間質(zhì)纖維化過程的影響，以此來探索糖生物學在腎間質(zhì)纖維化中作用。

    （一）糖基化修飾在腎間質(zhì)纖維化中作用的體外實驗研究

    在體外實驗中，大連醫(yī)科大學腎臟病研究所課題組選用了人腎小管上皮細胞株2 （HUMAN KIdNEy2，HK2）細胞進行研究，首先用免疫熒光的方法確定HK2 細胞的胞漿和細胞表面均有中等量核心巖藻糖鏈的表達。

    然后，用5 NG/Ml TGFβ1 刺***K2 細胞48 H，結果發(fā)現(xiàn)TGFβ1 **后，HK2 細胞的核心巖藻糖基化水平明顯升高，這提示核心巖藻糖基化修飾可能在促進TGFβ1 誘導的TGFβ/SMAd2/3 通路激活中發(fā)揮作用。

    TGFβRII 與ALK5 是TGFβ/SMAd2/3 信號轉(zhuǎn)導通路的關鍵受體蛋白，為確定TGFβRII 與ALK5 與核心巖藻糖基化的關系，他們用異硫氰酸熒光素（FITC）小扁豆凝集素（LCA）與TGFβRII 或ALK5 進行免疫熒光測定蛋白與核心巖藻糖鏈的空間表達表位關系，結果顯示腎小管上皮細胞中TGFβRII，ALK5 與核心巖藻糖鏈的表達表位完全重合，提示TGFβRII 及ALK5 受體蛋白均受到核心巖藻糖基化的修飾。

    接著，他們通過基因沉默的方法沉默了FUT8 基因后，檢測TGFβ/SMAd2 /3 通路上TGFβRII 和ALK5 的變化。

    結果發(fā)現(xiàn)FUT8SIRNA 明顯降低TGFβRII 和ALK5 的核心巖藻糖基化水平；如前所述，受體TGFβRII 和ALK5 正常發(fā)揮功能是TGFβ/SMAd2 /3 通路激活的必要條件，那么，它們核心巖藻糖基化的缺失對其維持TGFβ/SMAd2 /3 通路激活的功能有什么影響呢？

    他們測定了TGFβ/SMAd2 /3 通路的活性，發(fā)現(xiàn)FUT8SIRNA 抑制了TGFβ1 誘導的PSMAd2 /3 的表達升高及其核轉(zhuǎn)位，這表明在腎小管上皮細胞中，F(xiàn)UT8SIRNA 通過抑制TGFβRII 和ALK5 的核心巖藻糖基化修飾而抑制TGFβ/SMAd2 /3 通路的激活，提示核心巖藻糖基化修飾是TGFβRII 和ALK5 發(fā)揮功能必需的。

    接下來，他們采用5 NG/Ml 的TGFβl 無血清刺***K2 細胞48 小時后，相差顯微鏡下觀察HK2 細胞形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)HK2 細胞失去了原來的鵝卵石樣形態(tài)，細胞呈現(xiàn)長梭形，細胞間隙擴大，排列紊亂，其上皮細胞表型特異性標志物ECAdHERIN 的表達出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，而肌成纖維細胞特異性表型α平滑肌肌動蛋白（SMooTH MUSClEACTIN，SMA），N鈣粘素（CAdHERIN），成纖維細胞特異蛋白1 （FIbRoblAST SPECIFIC PRoTEIN1，F(xiàn)SP1）的表達則明顯上調(diào)，提示TGFβl 成功誘導體外培養(yǎng)的HK2 細胞出現(xiàn)EMT。

    提前孵育FUT8SIRNA 能有效抑制E鈣粘素的表達降低，同時阻止αSMA，N鈣粘素以及FSP1 的表達升高。他們還發(fā)現(xiàn)，TGFβ1**細胞能明顯導致細胞凋亡，而提前孵育FUT8SIRNA 24 H能有效的阻止TGFβ1 誘導的細胞凋亡。

    該課題組的研究第一次展示了核心巖藻糖基化修飾對TGFβ1 誘導的腎小管上皮細胞損傷中TGFβ/SMAd2 /3 信號通路活化的影響，并進一步抑制腎小管上皮細胞的EMT。

    研究成果發(fā)表在美國生理學雜志上。為了進一步驗證以上發(fā)現(xiàn)，該課題組建立了單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）腎間質(zhì)纖維化大鼠體外實驗模型，利用腺病毒FUT8SHRNA 有效的抑制大鼠腎間質(zhì)組織中核心巖藻糖鏈的表達，觀察腎小管間質(zhì)中TGFβR 受體核心巖藻糖鏈的變化與腎間質(zhì)纖維化的關系。

    結果發(fā)現(xiàn)，隨著模型大鼠腎間質(zhì)纖維化的加重，腎小管間質(zhì)中的核心巖藻糖鏈表達水平逐漸上調(diào)，而注射腺病毒SHRNA 抑制大鼠FUT8 表達，能抑制TGFβRI 及TFGβRII 的核心巖藻糖基化修飾，進而抑制UUO 大鼠模型中的TGFβ/SMAd2 /3 信號通路的激活，作為這種分子干預的結果，UUO 模型中腎間質(zhì)纖維化被顯著抑制。

    值得注意的是，體內(nèi)外實驗均發(fā)現(xiàn)，在干預糖基化修飾過程中，TGFβR 表達水平并沒有受到影響。研究結果首次證實了腎間質(zhì)纖維化過程中TGFβR 的核心巖藻糖基化修飾發(fā)揮了關鍵性的作用，并發(fā)現(xiàn)其作用不依賴于所修飾蛋白本身的表達。

    研究結果發(fā)表在國際腎臟病雜志，美國德克薩斯州大學病理系教授ManjeriA及美國密西根大學醫(yī)學部教授Joel M為該研究撰寫了專欄述評，述評指出作者檢測到在腎臟損傷模型中，利用糖生物學方法能夠及時、有效、顯著的抑制TGFβ通路并阻斷腎間質(zhì)纖維化進程，這一發(fā)現(xiàn)非常新穎，為腎臟中TGFβ通路調(diào)節(jié)的研究添加了新的啟示，這是首次以嶄新的視角檢測TGFβ受體功能并為未來的研究打下了基礎。

    （二）蛋白尿致腎間質(zhì)纖維化的糖生物學機制

    上述研究只是從單一信號通路角度探討腎間質(zhì)纖維化的糖生物學機制，而臨床上往往是多因素共同作用促進腎間質(zhì)纖維化，蛋白尿就是一種能激活多個促纖維化通路的病理過程。

    研究證實，蛋白尿可作為一個***的病理因素直接導致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生，它已經(jīng)成為預測慢性腎臟病的不良預后最強烈的危險因素，但其導致腎間質(zhì)纖維化的具體機制并不十分清楚。

    大連醫(yī)科大學腎臟病研究所課題組試圖在以往基礎上進一步探討糖基化修飾在蛋白尿?qū)е履I間質(zhì)纖維化過程中的作用。

    腎小管上皮細胞能通過位于腎小管刷狀緣上的MEGAlIN 受體聯(lián)合CUbIlIN 過度內(nèi)吞尿蛋白，導致腎小管上皮細胞氧化應激、炎癥損傷，進而促進腎間質(zhì)纖維化發(fā)生，MoToyoSHI 等報道，當小鼠腎小管上皮細胞的MEGAlIN 基因被敲除后，腎小管無法吸收白蛋白，炎癥反應減弱，小鼠腎間質(zhì)纖維化減輕；

    而表達MEGAlIN 的腎小管上皮細胞的單核/巨噬細胞趨化蛋白（MoNoCyTE /MACRoPHAGE CHEMoTACTIC PRoTEIN1，MCP1）增加，炎癥損傷加重，小鼠腎間質(zhì)纖維化明顯。因此，MEGAlIN 被認為是尿蛋白超負荷導致炎癥反應的決定性因素。

    結構研究表明，MEGAlIN 屬于糖蛋白，它受到核心巖藻糖基化的修飾。因此，推測核心巖藻糖基化修飾能夠影響MEGAlIN 吸收蛋白的功能。

    為觀察FUT8 基因轉(zhuǎn)染后腎小管上皮細胞中MEGAlIN 綁定和內(nèi)吞白蛋白的變化，課題組首先用免疫熒光雙染測定MEGAlIN 是否受到核心巖藻糖基化的修飾，結果顯示MEGAlIN 與核心巖藻糖鏈的表達表位完全重合，這提示，MEGAlIN 蛋白的確受到核心巖藻糖基化的修飾。

    推測MEGAlIN 與白蛋白結合能力很可能受其核心巖藻糖基化修飾的影響，為證實這一設想，他們進一步利用共聚焦顯微鏡及流式細胞術分析白蛋白的結合和內(nèi)吞，二者結果顯示抑制MEGAlIN 的核心巖藻糖基化能減少腎小管上皮細胞對白蛋白的結合和內(nèi)吞，反之則能增加腎小管上皮細胞對白蛋白的結合和內(nèi)吞，這提示MEGAlIN 的核心巖藻糖基化修飾是其結合和內(nèi)吞白蛋白所必需的。

    為觀察MEGAlIN 核心巖藻糖基化在白蛋白超負荷炎癥損傷過程中的作用，他們首先用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將FUT8SIRNA 片段以及高表達FUT8 基因載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞成功干擾了FUT8 目的基因。

    進一步檢測了FUT8 基因沉默及過表達后炎癥趨化因子MCP1 和受激活調(diào)節(jié)正常T 細胞表達和分泌因子（RANTES）的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT8 基因的高表達能明顯上調(diào)MCP1、RNATES 表達水平，而沉默F(xiàn)UT8 基因能明顯下調(diào)MCP1、RANTES 表達。

    有研究表明，炎癥趨化因子MCP1 及RANTES 的釋放是白蛋白內(nèi)吞依賴性的，而沉默了MEGAlIN 的核心巖藻糖基化能減少白蛋白的內(nèi)吞，所以，沉默了MEGAlIN 的核心巖藻糖基化，能減少細胞對白蛋白的內(nèi)吞而使炎癥趨化因子MCP1，RANTES 的表達下降，從而抑制了腎小管上皮細胞的炎癥損傷反應。

    這提示MEGAlIN 的核心巖藻糖基化修飾參與了白蛋白導致的腎小管上皮細胞的炎癥損傷過程，阻斷MEGlAIN 的核心巖藻糖基化修飾就能阻斷白蛋白導致的腎小管上皮細胞的炎癥損傷。

    本實驗中，首次發(fā)現(xiàn)核心巖藻糖基化修飾是MEGAlIN發(fā)揮結合和內(nèi)吞功能所必需的，揭示了腎小管結合和吸收蛋白過程中核心巖藻糖基化修飾的調(diào)控機制。

    此外，還發(fā)現(xiàn)抑制MEGAlIN 的核心巖藻糖基化能阻斷白蛋白過度吸收導致的腎小管上皮細胞炎癥損傷，這為臨床上抗蛋白尿損傷提供了新的思路，同時揭示了蛋白尿與糖基化修飾二者之間的聯(lián)系。以上研究，從糖生物學角度初步探討了腎間質(zhì)纖維化的糖生物學機制，為我們更深入的了解腎間質(zhì)纖維化，尋找抗慢性腎臟病進展的策略，提供了新的視角。